杂交虎龙斑消化道枯草芽孢杆菌的特性及其作为益生菌的作用

今天小编与大家分享一篇发表在Fish & Shellfish Immunology上的文章,杂交虎龙石斑鱼胃肠道枯草芽孢杆菌的特性及其作为益生菌添加剂的作用,引用信息如下:


抗生素的广泛使用导致了对水生和人类健康有害的抗生素耐药性。据报道,美国每年至少有200万人遭受严重的抗抗生素细菌感染,超过23万人死于这些抗抗生素细菌的感染。因而食品药品监督管理局(Food and Drug Administration)等部门限制了抗生素作为动物生长促进剂的使用。在这种情况下,应用益生菌可能是预防致病性感染的替代策略。
益生菌以许多积极的方式影响动物的健康,包括:(i)竞争性排除病原体,(ii)营养物质的产生和酶对消化的贡献,(iii)抑制物质的分泌,(iv)增强免疫反应和(v)改善水质。枯草芽孢杆菌能产生细菌素和枯草杆菌素,可用于食品保存和控制食物中毒。据报道,在养殖水体中施用枯草芽孢杆菌可以提高水质,提高幼年凡纳滨对虾对哈维弧菌感染的抵抗力,从而获得较好的生长性能。更重要的是,孢子往往在极端环境下具有很高的抵抗力,如胃液、胆汁和热处理,这可能有利于喂养。

益生菌被广泛用于改善动物的生长和健康。然而我国很少有海洋水生益生菌得到应用和许可。本研究从虎龙石斑鱼胃肠道分离到一株芽孢杆菌属菌株,鉴定为枯草芽孢杆菌新菌株,命名为7K。枯草芽孢杆菌7K具有良好的产孢能力,对加热、模拟胃液和模拟十二指肠液都有很好的耐受性,表明其具有作为益生菌的潜力。我们在枯草芽孢杆菌7K的分泌物中发现了7种抗菌药物,添加在饮食中可促进虎龙石斑鱼的生长。此外,枯草芽孢杆菌7K能抑制虹彩病毒的感染,因为能够作为维持鱼类健康的适宜益生菌。我们的研究结果还表明,枯草芽孢杆菌7K在病毒感染下对虎龙石斑鱼产生非特异性免疫反应。用含108和1010 CFU g-1枯草芽孢杆菌7K的饲料饲喂虎龙石斑鱼4~8周,虎龙石斑鱼的血清溶菌酶活性、血清补体活性(ACH50)、血清杀菌活性、呼吸爆发、超氧化物歧化酶活性(SOD)和头肾白细胞吞噬活性均显著增强。综上所述,枯草芽孢杆菌7K是一种在石斑鱼培养应用具有持久性、生长刺激性、增强免疫力和促进健康的益生菌。
本实验首先从虎龙石斑鱼胃肠道中筛选枯草芽孢杆菌。采集新鲜肠内容物样本后,为了排除非产孢细菌,将1g样品在无菌PBS缓冲液中稀释1:100,在80℃加热15 min。在4000 g条件下离心10 min 4℃后,将上清液加入LB培养基中,在37℃条件下培养24h。然后对培养基进行连续稀释以获得单克隆菌株。通过光学显微镜观察菌落颜色、形态、大小,16s rDNA测序以及常规生理和生化鉴定确定菌株的分类。系统发育分析、生理生化特征表明,分离株7K为枯草芽孢杆菌。随后将0,106、108和1010 cfu g- 1的枯草芽孢杆菌7K作为饲料添加剂喂养石斑鱼0-8周,主要实验结果如下:

1.细菌生长曲线
在自发酵罐中生长30小时后,枯草芽孢杆菌7K的生长进入稳定期,产孢率在48 h达到峰值(95%以上);摇瓶发酵过程中,枯草芽孢杆菌7K在18 h进入稳定期,营养细胞数在36 h开始快速下降,产孢率在33 h达到最高点(接近20%)。
  


2.耐热性和模拟Git条件的测定
通过在沸水浴中处理菌株获得了存活曲线。枯草芽孢杆菌7K的孢子经100 ℃加热2 min后,其存活率略有下降,表现出较高的耐热性;枯草芽孢杆菌7K的营养细胞经30 s热处理后存活率急剧下降,大肠杆菌也对热敏感,100 ℃热处理60 s后没有细胞存活。
在模拟胃液条件下,枯草芽孢杆菌7K的孢子数在第1 h的减少量小于5%。对枯草芽孢杆菌7K的营养细胞和大肠杆菌进行了相同的实验,细菌数量急剧减少,但是枯草芽孢杆菌7K的营养细胞对模拟胃液的耐受性显著优于大肠杆菌(p<0.05)。
在模拟十二指肠液中培养3 h,枯草芽孢杆菌7K的孢子表现出较高的耐受性,存活率接近100%。然而,枯草芽孢杆菌7K的营养细胞从6.43 log CFU ml−1下降到1.56 log CFU ml−1,显示出对模拟十二指肠液的高敏感性。大肠杆菌在模拟十二指肠液中的数量是稳定的,这表明大肠杆菌对模拟十二指肠液有耐受性。



3.细胞外抗菌试验
枯草芽孢杆菌7K的细胞外抗菌活性测定结果见表1。枯草芽孢杆菌7K发酵液上清液可形成抑制区,并具有胞外抗菌活性。在6种病原菌中,上清液对金黄色葡萄球菌、溶藻镰刀菌、溶血病弧菌和哈维弧菌均有抗菌作用,但对嗜水菌和外阴弧菌的抗菌作用较小。根据LC-HRMS分析,上清液中有7种主要物质(S1-S7)可能有助于抗菌效果。





4.枯草芽孢杆菌7K促进石斑鱼生长
实验结果如表2所示。实验开始时,食用益生菌补充饮食和对照饮食的石斑鱼的体重没有显著差异(p>0.05)。28天后,添加106、108和1010 cfu g- 1 枯草芽孢杆菌7K补充饮食组和对照组的石斑鱼在最终体重、增重、ADG, PWG和 FE 方面存在显著差异(p<0.05)。以106、108和1010 cfu g- 1 枯草芽孢杆菌7K补充饮食喂养的鱼在最终体重、增重、ADG, PWG和 FE 方面没有显著差异。益生菌补饲与对照组的存活率无显著性差异(p<0.05)。



5.枯草芽孢杆菌7K的保护作用呈剂量依赖性
  通过浸泡感染SGIV,在第3天之前,添加108和1010 cfu g-1 枯草芽孢杆菌7K补充饮食的鱼中未观察到死鱼。感染后10天,与对照组(73.33±5.77%)相比,108(46.67 ±11.55%)和 1010 cfu g-1(30± 0%)益生菌补充饮食的鱼的累积死亡率存在显著差异。此外,感染后10天,采用1010 cfu g-1益生菌补充饮食喂养的鱼的死亡率明显低于采用108和106 cfu g-1饮食喂养的鱼类(60.00±10.00%)。然而,采用106 cfu g-1饮食的鱼类与对照饮食的死亡率没有显著差异。



6.石斑鱼免疫相关基因的表达
  在0、106、108和1010 cfu (g diet)−1 条件下,经SGIV处理48小时后,食用枯草芽孢杆菌7K的组未观察到死鱼。108添加组鱼的MXⅠ, MXⅡ和ISG15 三种干扰素相关基因的表达水平明显高于对照组和106添加组。108添加组鱼MXⅠ和ISG15 的表达水平明显低于1010添加组。106和对照组鱼相比,只有ISG15的表达水平没有显著差异。
三种促炎细胞因子IL-1β、IL-8和TNFα在108和1010 添加组中的表达水平明显高于0、106组,在感染病毒48小时后,1010 添加组IL-8的表达水平明显高于明显0 cfu g−1添加组。值得注意的是,1010 添加组IL-1β的表达水平显著高于108 添加组,但TNFα的表达显著低于食用108 添加组。



7.饲料中添加枯草芽孢杆菌7K的石斑鱼的非特异性免疫参数
在养殖的0-8周中,与对照组石斑鱼相比,106、108和1010 cfu (g diet)−1 组石斑鱼的溶菌酶活性、呼吸爆发、ACH50、SOD活性、石斑鱼血清杀菌活性、头肾白细胞吞噬活性均有不同程度的增高,且部分参数呈剂量依赖性。



小结:
综上所述,本研究表明,从石斑鱼中分离得到枯草芽孢杆菌7K具有良好的抗性,并且具有潜在的益生菌的产孢能力。枯草芽孢杆菌7K的分泌物中含有多种抗菌物质,其显著的促生长作用以及对病原微生物感染的抑制作用使其成为一种有前途的益生菌。结果还表明,枯草芽孢杆菌7K对石斑鱼的非特异性免疫反应有较好的促进作用,并可增加病毒感染时的免疫相关基因表达。总之,枯草芽孢杆菌7K是一种可用于水产养殖的有效的益生菌。